一、蛋白與多肽
蛋白質(zhì)與多肽具有相同的氨基酸骨架
→ 一般來講，分子量超過10,000的稱為蛋白，小于10,000的稱為多肽。但其實即使這種分類也還是模糊的。
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蛋白質(zhì)因為折疊具有特殊的空間構(gòu)造。
→?酸性或堿性溶液可以破壞這樣的構(gòu)造而使蛋白失活
→ 使用溫和以維持蛋白活性的檢測條件非常必要
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多肽分子尺寸越小，其獲得特殊空間構(gòu)造越困難
→ 比起蛋白分離，多肽分離條件的選擇自由度大（可使用有機溶劑）
→ 環(huán)狀多肽還是有些特殊立體構(gòu)造的（特殊多肽的個別應(yīng)用）
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多肽是α-氨基酸的α位氨基和羧酸脫水縮合而成的產(chǎn)物
→ 在末端有未反應(yīng)的氨基、羧基存在
→ 所以有N末端、C末端的叫法
→ 在記述氨基酸序列時，N末端在左側(cè)、C末端在右側(cè)（因此，Lys-Arg和Arg-Lys是不同的多肽）
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二、多肽醫(yī)藥品與其他醫(yī)藥品的比較
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低分子化合物 | 經(jīng)典多肽 | 特殊環(huán)狀多肽 | 抗體** | |
分子量 | 1,000以下 | 500-6,000 | 600-2,500 | 150,000以上 |
活性 | 普通~高 | 高~極高 | 極高 | 極高 |
特異性 | 低 | 高 | 極高 | 極高 |
PPI*阻礙 | 困難但可能 | 可能 | 可能 | 可能 |
血中穩(wěn)定性 | 低~普通 | 極低~低 | 普通~高 | 極高 |
口服 | 可以 | 幾乎不可以 | 可以*** | 不可以 |
毒性?副作用 | 多 | 少 | 少 | 少 |
細胞內(nèi)靶點 | 可 | 幾乎不可 | 可 | 不可 |
生產(chǎn)成本 | 低 | 低~普通 | 低~普通 | 高 |
* 蛋白與蛋白間的相互作用
** 完整抗體，不含Fab、scFv等
*** 取決于分子量或環(huán)狀多肽Linker的大小
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三、多肽的色譜分離條件
1.?多肽的分離常使用中性--酸性流動相
?2.?堿性條件下，可能會發(fā)生：
Asn/天冬氨酰（有時候Gln/谷氨酰胺也是）脫胺
Asp/天冬氨酸 → isoAsp
S-S交換反應(yīng)
3.?下列色譜分離模式更多使用中性--酸性流動相
反相色譜（RPC）
離子交換色譜（IEC）：尤其是陽離子交換色譜（CIEC）
尺寸排阻色譜（SEC）
正相色譜（NPC?HILIC）
親和色譜（AFC：尤其是金屬螯合親和色譜（IMAC）
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四、TSKgel尺寸排阻色譜柱在多肽分離分析中的應(yīng)用
尺寸排阻色譜（SEC）：利用色譜填料的細孔徑、基于分析物尺寸大小達成分離的模式。
※?選擇排阻界限在10000以下的SEC色譜柱
TSKgel UP-SW2000, SuperSW2000, G2000SWXL, TSKgel G2500PWXL, etc.
※?優(yōu)勢
色譜條件單純，利于品質(zhì)管理的使用。
根據(jù)分子量（尺寸）大小可以預(yù)判洗脫位置。
※?缺點
樣品可進樣量相對較小。
分析物可能會與固定相（色譜填料）發(fā)生疏水相互作用（→ 添加有機溶劑）。
※?流動相推薦
流動相：0.1 % TFA＋ 45% 乙腈（0.1 % TFA非必須）。
同種流動相，含有蛋白組分時蛋白的空間構(gòu)造被破壞，分子呈伸展?fàn)顟B(tài)（變性），這時候進行分子量表征時，使用100 %水溶液條件下標(biāo)準(zhǔn)蛋白校正曲線不合適。
含0.1 % TFA的流動相分析疏水性高的多肽時，如果洗脫較遲，可以推薦使用醋酸溶液等。
色譜柱 | 粒徑 | 多肽/蛋白分子量排阻范圍 | 特點 |
TSKgel?UP-SW2000 | 2?μm | 100?-?100000* | 分辨率最高、排阻范圍寬 |
TSKgel?G2000SWXL | 5?μm | 100?-?100000* | 分辨率高、排阻范圍寬 |
TSKgel?SuperSW2000 | 4?μm | 100?-?100000* | 分辨率高、排阻范圍寬 |
TSKgel?G2500PWXL | 7?μm | 100?-?5000 | 適用于低分子量多肽、耐堿 |
TSKgel?G3000PWXL | 7?μm | 1,000?-?50000 | 適用于高分子量多肽、耐堿 |
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參考譜圖
