第150期? 尺寸排阻色譜法填料的選擇

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一、什么是尺寸排阻色譜

利用填料的細孔，根據分析樣品中各分子大小的差異進行洗脫的分離模式。取Size Exclusion Chromatography 開頭字母，簡寫為SEC。由于填料與分析樣品之間不發生相互作用（如吸附）， 因此，這是一種分析樣品變性發生可能性較低的分離模式。此外，該模式只使用單一流動相，相對簡單的設備就能進行穩定的分析，且當知道有關分子量（大小）的信息時，還可以預測洗脫位置。另外，還有可以在保持聚體不解離的情況下即可對其進行分離的一大特長。 分離模式圖如圖1-1 所示。色譜柱中充填了具有幾十到幾百納米細孔的填料。分子通過色譜柱時，尺寸較小的分子滲透至填料的細孔內部，像繞行一樣繞過色譜柱內部流過。另一方面，尺寸較大的分子由于無法滲透至細孔內部，從填料外側流過。結果，分子尺寸較大的分子較早洗脫，較小的分子較晚洗脫。

圖1-1 尺寸排阻色譜法的分離示意圖

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? ? 圖1-2 是色譜柱內示意圖和分子量計算用校正曲線示例。校正曲線是通過測定已知分子量的分子量標準物質，以各自的分子量對數與洗脫體積（或洗脫時間）繪制而來。比填料細孔直徑大的分子無法滲透到填料內部，因此，它們由填料外部體積部分流出，并從色譜柱中洗脫出來（這稱為空隙體積或排阻極限洗脫體積V_O）。無論什么分子，在理論上，其洗脫速度不會比V_O 快。另一方面，比細孔小的分子則根據尺寸滲透到細孔內部。流動相總體積V_M是流經填料外部的體積（V_O）和填料內的細孔內體積（V_i）之和（= 流動相體積，V_M= V_O + V_i）。因此，在理論上，沒有洗脫遲于V_M 的分子。該體積稱為總滲透極限洗脫體積。所有分子均在排阻極限洗脫體積（V_O）和總滲透極限洗脫體積（V_M）之間洗脫，從分子尺寸較大的開始，依次進行洗脫。

圖1-2 尺寸排阻色譜用色譜柱的示意圖和校正曲線

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二、填料選擇

1. 基質種類

尺寸排阻色譜主要有兩種填料，一種是以硅膠作為基質的硅膠類填料，另一種是以多孔聚合物為基質的聚合物類填料。由于蛋白的單個分子量通常在1萬到數十萬Da之間，分離時，一般使用在特定分子量區間中校正曲線斜率較緩的硅膠類填料的色譜柱。硅膠類填料機械強度高，耐壓性好，而且，還有小粒徑填料裝填的高分辨率色譜柱可選用。圖1-3是標準蛋白硅膠類填料的校正曲線，圖1-5是標準樣品的分離色譜圖。

? ? 另一方面，與硅膠類填料相比，聚合物類填料色譜柱的校正曲線的坡度較陡，但分子量分離范圍較寬，校正曲線的線性也很好，因此，適用于核酸等具有分子量分布的分析樣品的分離。另外，還有大孔徑的色譜柱，可適用于病毒和DNA等巨型生物大分子的分離。同時還具有耐堿性，可在較大的pH值范圍內使用，可以使用堿溶液進行清洗。圖1-4是標準蛋白聚合物類填料的校正曲線，圖1-6是標準樣品的分離色譜圖。

圖1-3 校正曲線（硅膠基質填料）??? ?????????圖1-4 校正曲線（聚合物基質填料）

圖1-5標準樣品的分離實例（硅膠基質填料）圖1-6 標準樣品的分離實例（聚合物基質填料）

2. 基質的種類和特點

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3. 孔 徑

孔徑決定可以分離的分子尺寸，因此，選擇適合所測分子孔徑的色譜柱是必要的。具體而言，應選擇所測分子在校正曲線較為平緩的范圍內洗脫的色譜柱。測定分子量分布較寬的分子時，可將填料孔徑不同的色譜柱串聯。

4. 粒 徑

粒徑越小，理論塔板數越高，分辨率就高。另一方面，壓力損失與粒徑的平方呈反比，粒徑越小時，色譜柱壓力越高。因此，選擇時需要同時考慮所使用的儀器的耐壓性能。使用不同粒徑的色譜柱分離標準樣品的色譜圖如圖1-7所示。可以看出，粒徑為5 μm 的 TSKgel G3000SWXL與粒徑為 2 μm 的 TSKgel UP-SW3000 相比，后者峰形更尖銳，理論塔板數也更高，即分辨率更高。

圖1-7 粒徑對分離的影響