前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來(lái)達(dá)到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對(duì)樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進(jìn)行過(guò)濾即可。
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溶液交換量
控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積30％為宜；
關(guān)注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時(shí)間間隔，可根據(jù)電導(dǎo)色譜峰確定下一次上樣時(shí)間。
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提高分辨率
1.保證填料裝填勻?qū)崳?/span>
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積5％為宜；
4.關(guān)注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強(qiáng)度和親水性；
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優(yōu)化對(duì)稱性
1.保證填料裝填勻?qū)?，拖尾→填料較松丨適當(dāng)增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
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出現(xiàn)肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
前處理
凝膠分離模式主要是靠分子量大小差異來(lái)達(dá)到分離的目的，前處理就顯得尤為重要。主要方式為對(duì)樣品進(jìn)行離心和過(guò)濾，離心可以除去大部分塊狀物，再用針式濾器進(jìn)行過(guò)濾即可。
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溶液交換量
控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積30％為宜；
關(guān)注樣品溶液體積濃度，可以分多次上樣，注意每次上樣時(shí)間間隔，可根據(jù)電導(dǎo)色譜峰確定下一次上樣時(shí)間。
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提高分辨率
1.保證填料裝填勻?qū)崳?/span>
2.增加柱床高度；
3.控制上樣體積，以不超過(guò)柱床體積5％為宜；
4.關(guān)注樣品黏度和取代溶液黏度是否保持一致；
5.根據(jù)樣品特點(diǎn)選擇更優(yōu)的取代溶液，優(yōu)化取代溶液的離子強(qiáng)度和親水性；
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優(yōu)化對(duì)稱性
1.保證填料裝填勻?qū)崳衔病盍陷^松丨適當(dāng)增加裝柱壓力，前沿反之；
2.使用太久柱料臟了→填料再生。
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出現(xiàn)肩峰
1.柱床：重新裝柱或反沖；
2.篩板：超聲清洗篩板；
蛋白質(zhì)和親和介質(zhì)不結(jié)合
1.?標(biāo)簽未翻譯或標(biāo)簽被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)
需要檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置，標(biāo)簽移到其它位置仍被包裹在結(jié)構(gòu)內(nèi)部時(shí)，就要將標(biāo)簽暴露出來(lái)
2.?優(yōu)化結(jié)合緩沖液及充分平衡層析柱
調(diào)整緩沖液（如金屬鰲合介質(zhì)和His標(biāo)簽蛋白結(jié)合時(shí)pH應(yīng)在7.3-8.5之間，在如肝素親和介質(zhì)和DNA聚合酶結(jié)合時(shí)鹽濃度太高影響結(jié)合，應(yīng)控制在50mM以下）。
層析柱沒(méi)平衡好，柱床體系中的環(huán)境如pH，離子強(qiáng)度也會(huì)影響結(jié)合，層析上樣前要充分平衡層析柱。
3.?增加結(jié)合時(shí)間
降低上樣流速讓蛋白和介質(zhì)有充分的接觸時(shí)間。
4.?更換更優(yōu)層析介質(zhì)
親和介質(zhì)分類(lèi)，一類(lèi)是特異性結(jié)合一種蛋白，另一類(lèi)是特異性結(jié)合一類(lèi)蛋白。（如蛋白a介質(zhì)結(jié)合一種蛋白，而肝素個(gè)質(zhì)結(jié)合一類(lèi)蛋白。所以選擇的時(shí)候我們一定要了解其原理。）
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蛋白結(jié)合在柱子未洗脫出
1.?蛋白和介質(zhì)結(jié)合力過(guò)強(qiáng)
增加洗脫強(qiáng)度（his蛋白和鎳柱結(jié)合，可以增加取代基咪唑的濃度）。
2.?蛋白聚集在層析柱上
通過(guò)調(diào)整層析過(guò)程的緩沖液增加蛋白的穩(wěn)定性，改善蛋白在層析柱上的狀態(tài)。
聚集在層析柱上時(shí)就要對(duì)層析柱進(jìn)行CIP清洗。
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低分辨率（洗脫后純度低）
1.層析過(guò)程流速的影響
調(diào)整層析過(guò)程的流速，流速影響蛋白質(zhì)和介質(zhì)的親和力，層析時(shí)要選擇合適的流速。
2.柱床未充分淋洗
上樣后，要對(duì)柱床進(jìn)行充分的淋洗，將未和介質(zhì)結(jié)合的留在介質(zhì)顆粒間隙，孔內(nèi)的蛋白洗出來(lái)，再洗脫。
3.蛋白之間的非特性結(jié)合
優(yōu)化體系緩沖液（比如加入10%的甘油等減少蛋白之間的非特異性結(jié)合）。
4.介質(zhì)的非特異性結(jié)合
優(yōu)化緩沖液，減少層析過(guò)程的非特異性結(jié)合（如His蛋白用金屬鰲合填料純化時(shí)，可以在緩沖液中加入300mM的氯化鈉，減少蛋白和介質(zhì)的非特異性結(jié)合）。
5.洗脫過(guò)程的影響
如肝素柱子洗脫過(guò)程中拉合適的鹽梯度可以提高特異性，His標(biāo)簽蛋白和金屬鰲合介質(zhì)結(jié)合后，洗脫時(shí)拉咪唑梯度可以提高純度。
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蛋白質(zhì)純化過(guò)程中失活
1.蛋白去折疊或聚集
優(yōu)化緩沖液使其利于蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定。蛋白質(zhì)在介質(zhì)上的高密度下容易聚集可以添加一些蛋白的增溶劑等。
2.純化過(guò)程中保持蛋白的活性的輔助因子被法除
如一些酶類(lèi)的活性需要金屬離子輔助其活性，在純化過(guò)程中就要添加蛋白的活性輔助因子。
